聚丙烯酰胺凝胶电泳作为检测DNA序列差异的有效手段，变性凝胶电泳在我室广泛使用，但是也有其使用范围。在我室还有一种常用的非变性凝胶电泳技术，简称SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism，单链构象多态性)。

原理：在SSCP测定中，双链DNA(dsDNA)被变性成为单链DNA(ssDNA)，每一条单链DNA都基于它们的内部序列而呈现出一种独有的折叠构象，即使同样长度的DNA单链因其碱基顺序不同、甚至单个碱基的不同会形成不同的构象。这些单链DNA在非变性条件下，用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，单链DNA的迁移率和带型，都取决于其折叠构象和电泳时的温度。

SSCP与变性凝胶电泳基本一致，不同之处有以下几点：

a. SSCP使用非变性凝胶进行电泳，即在凝胶配制中不加入变性剂。我室常用8%非变性胶(丙烯酰胺 80g，N- N，-亚甲双丙烯酰胺 2.76 g，10×TBE 50ml，加水定容到1L)

b. 工作环境，由于SSCP受温度影响，所以在电泳过程中应防止温度的升高，所以电泳环境为电压400V，电流50mA，单板电泳功率为9W，不用预热。缓冲液最好用新配制的。

c. 由于电泳功率较低，所以电泳时间较长，通常需要10小时以上，因此一般电泳需要过夜。室温在25。C以下。

1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量的蛋白质，小于1kb的DNA片段和DNA序列。分析装载的样品容量大，可回收，DNA纯度高。在催化剂TEMED(N-N-N，- N，-四甲基乙二胺)和过硫酸胺的作用下，丙烯酰胺聚合成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N- N，-亚甲双丙烯酰胺的参与下，聚丙烯酰胺链与链之间交叉联结形成凝胶。

1.1 配制30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g

N- N，-亚甲双丙烯酰胺 1g

加水至100ML，40C棕色瓶可保存二月

1.2 配制5×TBE缓冲液：

TRIS碱 54克

硼酸 27.5克

EDTA 3.72克

加水至1L

1.3 制备聚丙烯酰胺凝胶所用试剂体积

试剂制备不同浓度(%)凝胶所用试剂体积(ml)

3.55.08.012.020.0

30%丙烯酰胺11.616.626.640.066.6

水67.762.752.739.312.7

5×TBE20.020.020.020.020.0

10%过硫酸铵0.70.70.70.70.7

1.4 DNA在聚丙烯酰胺凝胶中有效分离范围

丙烯酰胺(%)有效分离范围(bp)二甲苯氰FF溴酚蓝

3.51000-2000460100

5.080-50026065

8.060-40016045

12.040-2007020

15.025-1506015

20.06-1004512

2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳具体步骤

2.1从NaOH池中捞出浸泡的玻璃板，取出上面的残胶

2.2 把玻璃板拿到流动水处洗刷干净

2.3 洗干净的玻璃板至于玻璃板架上晾干

2.4 用乙醇擦洗玻璃板

2.5 带凹口的背板涂上硅化剂，面板则涂上粘合剂，防止电泳完毕发生撕胶和脱胶的可能(涂摸要均匀)

2.6 面板在下，背板在上。两侧用塑料板密封，并用夹子夹好。底部调节使之水平

2.7 将加入催化剂后的凝胶沿凹口均匀倒下，插入适当的封条。勿使封条下留下气泡。用夹子夹紧封条部位

2.8 室温聚合30分钟，小心取出凹口处封条，用水冲洗加样孔(否则封条所残留的丙烯酰胺在加样孔聚合产生不规则表面，引起DNA带变形)

2.9 将凝胶固定在电泳槽里。带凹口背板朝里，面向缓冲液槽

2.10 用0. 5×TBE灌满电泳槽的缓冲液槽，接上电极，打开电源。调试工作环境为电压2000-2200V，电流150-200mA，单板电泳功率为80W。预热30分钟左右。

2.11 点样之前需切断电源，用枪将点样孔的气泡及胶吹出，然后插入点样梳，注意不要插得太深，否则点样胶面会变形，影响美观及点样。

2.12枪吸加样品，PCR产物先加loading buffer 10ul ,再变性5分钟左右，接着在冰水中冷却5分钟以上方可点样，点样完毕，电泳开始。

2.13 电泳至所需位置后，切断电源，拔出导线，回收缓冲液，卸下玻璃板。在工作台上，将背板撬起，放回原处。将面板进行银染

3. 电泳后的银染检测

3.1 原理：

影像产生是由于核酸在胶上所占部位与周围的氧化——还原势不同而产生。银染液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，这样核酸电泳带就染成了黑褐色。

3.2 银染

银染液的配制：称2.5至3.0g AgNO3加1200---1400ml水

银染:将电泳完的面板首先在银染漂洗盆了漂洗赶紧，使胶面上没有异物。玻璃板反面没有污染物。

将加入银染液的银染盆放在摇床上后，将面板放入银染1小时左右。

3.3 显影

显影液的配制：NaOH---20g, Na2CO3----0.6g,甲醛4.5ml，加水1200ml

显影：将面板从银染盆里取出，在银染漂洗盆里漂洗，震荡5-6次，取出后使其表面尽量无水，再放入已加入显影液的显影盆里(显影，显影液的配制及甲醛的加入都需要在通风橱的摇床上进行)显影过程大约10到15分钟，以DNA条带清晰可见为准。

将显现完毕的板子在显影漂洗盆里漂洗后，方可读带。

本实验室凝胶电泳相关常用试剂配方：

1. 我实验室常用的聚丙烯酰胺凝胶是6%变性聚丙烯酰胺凝胶(简称变性胶，PAGE)，就是在普通聚丙烯酰胺凝胶中加入变性剂。我们使用的变性剂是尿素。

6%PAGE具体配制方法为:

尿素210g，10×TBE 25ml ，丙烯酰胺28.5 g ，亚甲双丙烯酰胺 1.5g，加水定容至500ml，过滤后使用。

考虑到方便使用的问题，一般一次配制2L(尿素840g，10×TBE100ml，丙烯酰胺114g，亚甲双丙烯酰胺6g)。

2. 10×TBE(Tris-硼酸-EDTA)的配制

EDTA 7.44g，硼酸55g，Tris 108g，加水定容至1000ml

3. 10%过硫酸氨(AP)

10g过硫酸氨，纯水定容至100ml

4. 硅化剂配方

二甲基二氯硅烷：无水乙醇=13ml：500ml

5. 反硅化剂(粘合剂)配制

无水乙醇 500ml(一瓶)，44ddH2O，3.3冰醋酸，550ul Bind silnce(3，-Trimethoxysilyl propyl)

配置完遮光4。C保存

6 loading buffer 配制

0.1g 二甲苯氰，0.1g 溴酚蓝，1ml 0.5molEDTA ，100mL甲酰胺